产品储存：

4℃保存，有效期 12 个月。

1、制品说明：

Protein A 4FF 蛋白纯化试剂盒是一款能够高效完成免沉淀(IP)及免共沉淀 CO-P 实验的试剂 盒其包含高性能 ProteirA/G Magoly Beads，能够实现快速便捷的磁性分离。另外试剂盒 内经过优化的援冲液，为免疫沉淀实验提供了良好的反应条件，增强了免疫沉淀实验的稳 定性聚合物磁珠的配体是重组蛋白 A/G(约 14kDa ，同时拥有蛋自 A 和蛋白 G 的 gG 结合 结构域，具有更广的抗体亚型结合范围。试剂盒的洗脱方式多样，既可以用低 PH 的洗脱液  将免应合物从蛋白 A/G 磁珠上洗脱，也可以使用电泳上样组冲液以变性条件洗脱免疫复合 物，直接进行后续检测分析。

本产品可广泛应用于细胞裂解物、细胞分泌上清、血清、腹水等样品中抗原的免疫沉淀反 应。

 2、操作步骤：

 2.1 缓冲液的准备

 可使用试剂盒准备的缓冲液，也可根据实际情况 配制不同的级冲液体系。kemix/Wh  Buffe5x)在使用前请释至并标记为 1xkemix /MashEuffer,另根据需求,补加终汰度为

0.1%-1% 的 Lysis/Wash Buffer Enhanced,标记为 1xLysis/Wash Bufe(Enhanced) 所有缓 冲液在使用前建议用 0.22 pm 或者 0.45 m 膜过释后的液建议 4C 保存,若试剂浑浊请立即 丢弃.

下列可能用到的试剂及材料未提供，需额外准备:

1)电泳上样缓冲液,非还原性(5x): 0.3 MTsC,pH 6.8,5% SDS,50% 甘油,0.5% 澳酚蓝 2)二硫苏糖醇(DTTT

3) 蛋白酶抑制剂

4)免疫沉淀所用抗原、抗体

2.2 样品准备

方案 I; 贴壁细胞的裂解

1)小心去除单层细胞的培养基

2)用预冷 PBS 清洗细胞两次

3)根据表 2 的推荐体积向细胞中加入预冷的 Wash BuferEnhanced)冰上育 5 min, 期问混匀几次。

4)将上述裂解好的样品转移至一个新的离心管中,约 13000xg 离心 10 min,分离细胞碎片 5 将上清转移到一个新管中，进行蛋白浓度测定及后续实验，标记为细胞裂解样品。

针对各种培养皿的 1x MashEuffer(Enhanced)的推荐使用体积

方案 II:悬浮培养细胞的裂解

1)将细胞悬液以 1000xg 离心 5min,收集细胞，弃上满

2)用预冷 FBS 将细胞团轻轻重，细胞县液以 1000xg 离心 5mn,收集细胞弃上清

3)向细脂团块中加入预冷 1xLysisWashBuffer (Enhanced)每 50mg 细圈团块便用 500L。

4)将上述要好的样品在冰上育 5mn,期间湿匀几次 13000xg 离心 10min,去除细胞碎片。 

5)将上清转移到一个新管中,备蛋白浓度测定及后续实验，标记为细胞裂解样品.

2.3 免疫沉淀

抗原、抗体与磁珠的结合顺序可根据实际情况调整,不同的孵育顺序对最终纯度及抗原产量 均有影响,以下方案为推荐常用的实验方法。

2.3.1 磁珠  洗

1) 将 ProteinA/G MagPoly Beads 充分混匀，取 20uL(0.2mg)加入 1.5mL 离心管中.

2) 向磁珠中加入 180uL 1x WashBuffer (Enhanced)轻微涡旋混匀。 3) 将离心管置于磁分离器上，待磁珠全部吸附后，吸弃上清。

4) 向离心管中加入 1 ml Wash Buffer (Enhanced),颠倒离心管数次或轻微涡旋混 1min 将离心管置于磁分离上，特强珠全部吸附后,吸弃上清。

2.3.2 免疫沉淀

方案 I

1) 向上述准备好的磁珠(步骤 2.3.1)中加入抗体,抗体推荐用量 2-10ug，用抗体保存液 或 1x Wash Bufer 补充体积至 500 uL，室温混旋孵育 30 min,将离心管置于磁分 离器上,待磁珠全部吸附后,吸取上清,留样用于检测。

注:育温度和时间范围推荐为:室温、30 min-2h,或者 4℃ 1h-16h,根据实际的结合效果进 行调整。

2)向离心管中加入 500uL 1x Wash Bufer,颠倒离心管数次或轻微涡旋混匀 1 min, 将离心管置于磁分离器上,待磁珠全部吸附后,吸弃上清,重复至少两次。

3)向离心管中加入 500uL 细胞裂解样品(步骤 2.2）,每个免沉淀反应推荐的总蛋白量为  500-1000ug :体积不足 500UL 可用 1x Wash Bufer (Enhanced)补足,室温混旋孵育 30min,将离心管置于磁分离器上,特磁珠全部吸附后,吸取上清,样用于检测。

注:孵育温度和时间范围推荐为:室温 30 minh,或者 4℃ 1h-16h,根据实际的结合效果进行 调整。

方案 II

1) 在离心管中,将细胞裂解样品(步骤 2.2)与抗体混合孵育 30 min。

推荐抗体用量为 2-10ug,每个免疫沉淀反应荐的胞裂解液总蛋白量为 500-1000ug，体积不 足建议用 1x Wash Bufer (Enhanced)将样品体积调整至 500uL。

2) 将孵育后的样品加入准备好的磁珠(步骤 2.3.1)中混旋孵育。

注:孵育温度和时间范围推荐为:室温 30 minh,或者 4℃ 1h-16h,根据实际的结合效果进行 调整。

3) 将离心管置于磁分离器上，待磁珠全部吸附后,吸取上清，留样用于检测。

2.3.3 磁珠漂洗

1)向离心管中加入 500uL  1x Wash Bufer (Enhanced),颠倒离心管数次或轻微涡旋 混匀 1 min,将离心管置于分离器上,待磁珠全部吸附后，吸附上清，重复一次。

2)向离心管中加入 500uL 1x Wash Bufer (Enhanced)，连同磁珠转移至一个 新 EP 管 中,颠倒离心管数次或轻微涡旋混匀 1min,将离心管置于磁分离器上,待磁珠全部吸附后，

吸弃上清。

2.3.4 洗脱

方案 I 低pH 洗脱

向离心管中加入 50uL IP Elution Buffer,室温混旋孵育 10 min,将离心管置于磁分离器 上,待磁珠全部吸附后,吸取上清为洗脱液加入 5-10 L Neutralization Buffer。

方案 II 备选洗脱方法(变性洗脱)

向离心管中加入 50uL(1x)电泳上样缓冲液,将样品置于金属浴中，96-100℃加热 10 min。 通过磁分离器分离磁珠,保留含有目的抗原的上样缓冲液。

注:两种洗脱方案均包含捕获抗体及目的抗原,低 pH 洗脱样本中抗体为完整结构,变性洗脱样本中抗体解离为重链、轻链,请根据后续实验需求选择洗脱方案。

注意事项：

1)在进行免疫沉淀操作之前,请务必认真阅读此说明书

2) 除非另有说明,所有操作建议于 8℃下进行。

3)在保证洗杂效果的前提下,如果使用 1x Wash Buffer (Enhanced) 洗杂,会造成抗 体和介质,或者抗原和抗体之间结合效果降低,建议可以使用 1x Wash Buffer 进行 洗杂。

4)磁珠应保存在储存溶液中，防止干燥，使用前请充分混匀。

5) 如果需要在还原条件下洗脱,向 1x 电泳上样缓冲液中加入 DTT(终浓度 10-20 mM)。 6)经煮沸后的填料易聚集并且失去抗体结合能力,经煮沸的填料不应再次使用。

7)为保证最佳的实验结果，请选择特异性较强的抗体进行免疫沉淀反应。

8)对于免疫沉淀实验，若本试剂盒提供的缓冲体系不能获得很好的实验结果,可自行优化缓 冲液进行实验。

9) 实验设计时，建议加入对照组，以备后续实验结果分析。

10)在确定实验结果前,建议保留各步骤抗原、抗体孵育后的样品以备验证。