1. 产品组分
组分
Super Fusion Cloning Mix (2×)
pUC19 Control Plasmid, linearized (Ampr,40ng/μL)
500 bp Control Fragment (20 ng/μL)
注： -20℃保存，两年有效。微量体积试剂请在正式实验开始前进行瞬时离心操作。
2. 产品介绍
基于重组原理的无缝克隆技术，作为新一代的克隆方法，不依赖繁琐的酶切、同源序列的重组，可将插入片段克隆 至任意线性载体的任意位点连接步骤，也不需要末端补平等操作，依据 DNA 片段 与线性化载体末端的 15~25 nt，载体自连背景极低，是一种简单、快速、高效的 DNA 定向克隆技术以上。一次反应可完成单至多个重组，最快仅需 5 分钟即可完成单片段重组，且阳性率高于 95%。Mix 中添加的辅助因子，有效提高克隆 阳性率；经优化的反应体系，能够一定程度上耐受未纯化 PCR 产物 中含有的杂质。
3. 使用方法
一． 制备线性化克隆载体
选择合适的克隆位点，对载体进行线性化，线性化载体可以通过酶切或者反向 PCR 扩增完成。
（1） 酶切制备
双酶切：线性化完全，转化背景（假阳性克隆）低；
单酶切：线性化程度差，可通过适当延长酶切时间来减少环状质粒的残留。
注 1：双酶切无需去磷酸化，单酶切需要去磷酸化；
注 2：酶切完成后，应将快速内切酶失活或对目的产物纯化后再用于重组反应。
（2）反向 PCR 扩增制备
载体质粒 DNA 为模板，克隆位点为分界点，设计一对反向引物，推荐使用高保真 PCR Mix 进行扩增。
二． 设计插入 PCR 引物片段
PCR 引物的 5’端必须包含与其相邻片段（插入片段或载体）末端同源的 15~25 nt（推荐 18 nt）序列。假如载体为粘性末端，且 3’端突出，则引物设计必须包含突出部分；若 5’端突出，则引物设计可以包含突出部分，也可以不包含。
插入片段正向扩增引物：
5’—上游载体末端同源序列+酶切位点（可选）+基因特异性正向扩增序列—3’
插入片段反向扩增引物：
3’—基因特异性反向扩增序列+酶切位点（可选）+下游载体末端同源序列—5’
注：尽量选择无重复序列且 GC 含量均匀的区域进行克隆，当载体克隆位点上下游 25 nt 区域内 GC 含量为
40~60%时，重组效率最高
三． 插入片段的 PCR 扩增
推荐使用高保真 PCR Mix 进行扩增，以减少扩增突变的引入。建 议使用纯化后的 PCR 产物进行无缝克隆反应，若 PCR 产物经琼脂糖 凝胶电泳鉴定为特异性扩增产物，可直接使用，但加样体积不应超过 总反应体积的 20%。
四． 无缝克隆反应
1. 冰水浴中配制以下反应体系：
a. 适载体用量（ng）= 0.02×载体碱基对数，即 0.03 pmol。
b. 插入单片段时，最适片段用量（ng）=0.04×片段碱基对数；插入多片段时，每片段最适用量 （ng）= 0.02×片段碱基对数。
注 1：如果插入的单片段长度大于载体，那么应互换载体与插入片段用量；
注 2：如果插入的片段长度小于 200 bp，那么要使用 5 倍载体的用量；
注 3：如果按上述公式计算得到的用量低于最低/高于最高值，那么建 议直接按最低/最高用量 使用
注 4：载体或插入片段过长，片段数量过多，均会降低阳性率。
重组反应体系配制完成后，轻轻吹吸数次混匀各组分，避免产生气泡即可，切勿涡旋。
2. 将反应体系置于 50℃，反应 5-60 min。
注 1：推荐使用温控比较精准的仪器进行反应，如 PCR 仪，反应时间不足或过长都会降 低克隆效率；
注 2：插入 1~2 个片段时，推荐反应时间为 5~15 min；插入 3~5 个片段时，推荐反 应 时间为 15~30 min；
注 3：当载体骨架在 10 kb 以上或插入片段在 4 kb 以上时，建议延长反应时间到 30~60 min；
注 4：50℃反应完成后，建议进行瞬时离心，将反应液收集至管底。
3. 将反应液离心管置于冰水浴中冷却，直接进行转化或储存于-20℃。
注：-20℃储存的重组产物，建议在 1 周内使用。
五． 克隆产物转化
在 100 μL 感受态细胞中加入 5-10 μL 反应液，轻柔吹吸混匀，置于冰上 30min。42℃热激 45~60s，冰浴 5 min。加入 500 μL SOC 或 LB 培养基，37℃振荡培养 40-60 min（200 rpm）。将菌液均匀涂布在含相应抗生素的平板上，倒置于37℃培养箱培养过夜。
注 1：不同感受态细胞最后的克隆阳性率会有所差别，推荐使用转化效率>10 8 cfu/μg 的感受 态细胞；
注 2：PCR 产物与线性化载体的数量和纯度决定了菌落数；
注 3：阳性对照平板通常生长大量白色单菌落，阴性对照平板只生长很少的菌落。
六． 阳性克隆检测
菌落 PCR 鉴定：挑取单菌落置于 10 μL ddH2O 中混匀，95℃裂解 10 min，取1 μL作模板，进行菌落 PCR 鉴定。
酶切鉴定：将单菌落接种到抗性培养基中培养过夜，提取质粒进行酶切鉴定。
注 1：建议菌落 PCR 时，至少使用一条通用引物，可有效避免假阳性结果；
注 2: 必要时可进一步对阳性结果进行测序鉴定
