miRNAFirst-strand cDNASynthesis Kit

目录号：PR155

产品内容：

组成                                                      PR155-01 （25次）

miRNA RT Enzyme Mix                          50 μl

2×miRT Reaction Mix                              250 μl

RNase free H2O                                      1 ml

产品储存：－20 ℃ 保存。

制品说明：miRNA 第一链合成试剂盒本试剂盒采用在 Poly(A)加尾法原理， 首先miRNA 3’末端加 Poly(A)尾，再使用 Anchored oligo(dT)-universal tag 通用逆转录引物进行逆转录反应，最终生成 miRNA 对应的 cDNA 第一链。

本试剂盒采用特殊优化预混合 mix 将 Poly(A)加尾和反转录合并为一步完成，简化了操作步骤并提高 Poly(A)加尾和逆转录效率，该试剂盒具有可从 20pg-2μg 的 total RNA 中有效制备 miRNA 对应的 cDNA 第一链。一次合成的 cDNA 可检测多个 microRNA，节约了样品和成本。

注：该试剂盒须与 miRNA 荧光定量检测试剂盒（PR156）配套使用。

操作步骤：

一、miRNA 3’末端进行Poly (A)加尾和逆转录反应（第一链合成）

1. 解冻2 × miRNA RT Reaction Mix并混匀， miRT Enzyme Mix放于冰中备用，加入以下试剂至总体积20μl（最后加入miRNA RT Enzyme Mix）。

Components                                                    Volume（20 μl）                        Final Concentration

Total RNA                                                               x μl                                                     Up to 2μg

2 × miRT Reaction Mix                                           10 μl                                                    1 ×

miRNA RT Enzyme Mix                                 2μl (见注意事项)                                            -

RNase free H2O to final volume                               20 μl                                                   -

注意事项：miRNA RT Enzyme Mix 非常粘稠，溶液容易吸附在管壁和吸头外导致损失。

二、按照 miRNA 荧光定量检测试剂盒（PR156）进行real time PCR

*在反应中使用的total RNA 必须含有小分子RNA（miRNA)。此过程也可以使用富集的miRNA，单纯miRNA无法直接使用分光光度计定量，建议加入量为2μl ~5μl。可根据目的miRNA丰度决定加入量，但是对于低丰度miRNA 样品而言(如血清血浆提取物)，可直接加入最大体积8 μl。

 移液器轻轻混匀上述配制的反应液，短暂离心后在42℃反应60 min。85℃加热5秒钟失活miRNA RT Enzyme Mix ，合成的cDNA反应液可放置于-20℃保存；也可以直接进行下游PCR或者荧光定量PCR检测。

注：按照上述操作步骤得到的cDNA模板用于下游PCR或者荧光定量PCR检测时，可以根据实际情况选择使用量，对于特殊的检测体系中，高含量的cDNA模板易导致非特异性扩增，可根据所检测miRNA的丰度适当的稀释cDNA（5-10倍或者100倍）后使用。如果发现有非特异扩增条带，或者融链曲线显示有非特异扩增，往往提示cDNA模板过量， 可以尝试将上述cDNA模板稀释几十到几百倍甚至上千倍再使用。