miRNA Real-Time PCR Assay kit

miRNA 荧光定量 PCR 检测试剂盒

目录号：PR156

产品内容：

组成                                                                 PR156-01（50次）                                PR156-01（200次）

2 x miRNA qPCR Mix(With Sybr Green)                                    1.25 ml                                                                        1.25 ml×4

Reverse primer(10μM )                                                                  55 μl                                                                            55 μl×4

产品组成、储存：

-20 ℃ 避光保存至少6个月，使用前充分融解混匀。2 × miRNA qPCR Mix(With Sybr Green)短期使用可放在 4 ℃，避免反复冻融。Reverse primer(10μM )每次用完置-20 ℃保存。

制品说明：miRNA 荧光定量 PCR 检测试剂盒采用本试剂盒采用 SYBR® Green I 嵌合荧光法的原理进行 miRNA 荧光定量检测。本试剂盒包含 miRNA 荧光 定量检测的所有试剂，包括 2×miRNA qPCR Mix 和 Reverse primer。2× miRNA qPCR Mix（含 Sybr Green）是专门为 miRNA 定量检测而研发的 新一代预混形式的荧光定量 PCR 检测试剂，其中的 DNA polymerase 采 用的是抗体修饰的热启动形式， 配合特殊的 Buffer 体系，使反应特异性更好，灵敏度更高，并能在更广的范围内进行准确定量。

注：该试剂盒须与 miRNA 第一链合成试剂盒（PR155）配套使用。

需自备的试剂：

1. 分子生物学实验级别的水（无核酸酶）

2. 待检测miRNA对应的qPCR上游引物（Forward primer）

Forward Primer设计原则：

1. 遵循引物设计的最普遍原则。

2. 以成熟的miRNA 序列为基础，将U 替换成T，这是最基础和最简单的设计方法。

3. 试剂盒中提供的下游引物的Tm 值为65℃，设计上游引物的Tm65℃左右。

4. 若按照原则2 的方式直接设计的引物其Tm 值过低，可以在引物的5’端添加几个碱基（最好为G 或C 碱基）；也可以在3’端添加1 个或几个A 碱基；或者5’端和3’端同时修饰。

5. 若按照原则2 的方式直接设计的引物其Tm 值过高，可以在引物的5’或3’端去 掉几个碱基。

注意事项：

1. miRNA 第一链cDNA 的加入量不要超过real time PCR 体积1/10。

2. 对于特殊的检测体系中，高含量的cDNA 模板易导致非特异性扩增，根据所检测 miRNA 的丰度适当的稀释cDNA（10倍或者100倍）。

3. 本品中含有荧光染料Sybr Green I，保存本品或配制PCR反应液时应避免强光照射。

4. 2 x miRNA qPCR Mix不含参比染料ROX，客户并根据qPCR仪器技术指导决定是否需要加ROX参比染料，用于消除信号本底以及校正孔与孔之间产生的荧光信号误 差，配套ROX产品货号为PR111-Rox Reference Dye。

操作步骤：

1. 在室温融化2 x miRNA qPCR Mix和Reverse primer（10μM）。

2. 使用时请将2 x miRNA qPCR Mix上下颠倒轻轻均匀混合，避免起泡，并经轻微离心

后使用。如果试剂没有混匀，其反应性能会有所下降。注：请不要使用振荡器混匀。

3. 按照下表组分冰上进行反应液的配制

注： 提高特异性选择两步法。提高扩增效率选择三步法。