患者源性肿瘤类器官（PDTO）作为可靠的临床前模型，能够真实反映原发肿瘤的生理学特征，在肿瘤学基础研究、疾病建模、新药物研发和个性化治疗中具有重要意义。近期，有研究团队通过将肿瘤组织碎片中制备获得的中尺度胶原束与明胶相结合，制备了一种新型的仿生水凝胶（新型-gel），用于培养来自患者的肿瘤类器官。研究指出，新型-gel中培养的肺癌类器官（LCOs）相较于无中尺度胶原束的Con-gel，在直径、细胞活性和形态上显示显著提升，更贴近体内肿瘤的特征。此外，这些LCOs在新型-gel中保持了与原始肿瘤组织类似的组织学特征、突变谱、基因表达和药物反应，展示出广泛的应用潜力，有助于推动个性化医疗和定制治疗策略的发展。
创新点
复合水凝胶（新型-gel）的制备和表征。
新型-gel 支持患者来源的肿瘤类器官的活力和生长。
新型-gel 有效地再现了肺癌类器官中亲本肿瘤观察到的组织学和突变特征。
使用 新型-gel 培养的肺癌类器官仍保持了药物敏感性和长期培养能力
为了在体外模拟中等尺度胶原结构细胞外基质，作者利用肿瘤源性的细胞外基质(ECM)碎片制备获得中等尺度胶原束（新型B）。这些胶原束平均长度为90 ± 27 μm，平均直径为5 ± 1.5 μm。ECM碎片经过-80°C三次冻融去细胞化处理，有效去除了组织中残留的肿瘤细胞。在解冻后，利用高通量组织细胞粉碎机快速机械破碎诱导形成中等尺度的胶原束(图1)。
图1 中等微观尺度的复合水凝胶制备
为了探索具有中等尺度胶原结构的仿生水凝胶在增强来源于原发性肺癌细胞的肺癌类器官（LCOs）生长和迁移方面的能力，作者培养了18个LCOs，这些细胞直接来自原发性肺癌组织。在新型-gel中培养的LCOs呈现不规则的形态，与体内观察到的肿瘤特征一致，而对照组则显示为球状类器官。同时，选择将传统Matrigel和添加明胶的纳米级胶原（Nano-gel）作为对照组。结果表明，在新型-gel中的LCOs与Matrigel和Nano-gel中的相比，细胞数量更多，直径更大。此外，作者从肉瘤和甲状腺癌样本中获得了中等尺度胶原束，这两种类型的肿瘤类器官在新型-gel中得到了有效复现(图2)。
图2 新型-gel促进了患者源性LCOs的生长和繁殖
在新型-gel中培养的LCOs能够准确复制其母体癌组织的组织学特征至关重要。研究采用H&E染色和免疫荧光染色技术比较了在新型-gel中培养的LCOs与其母体肺癌组织的形态和分子特征。从肺腺癌细胞中衍生的LCO-4显示腺泡或大腺体结构，类似于其母体癌组织的结构，而在新型-gel中培养的LCO-4显示了与肺腺癌相关的分子标记物表达，包括napsin-A、甲状腺转录因子1、细胞角蛋白7以及细胞增殖标记Ki67，结果表明这种分子模式与其母体肺癌组织高度一致。综合表明，在新型-gel中培养的肿瘤类器官能够精确复制其母体肿瘤的组织学特征(图3)。
图3 新型-gel水凝胶培养的LCOs再现了亲代肿瘤的组织病理特征
新型-gel水凝胶中培养的LCOs保留了原始肿瘤的遗传学谱。通过WES分析4对原发性肺癌组织及其在Con-gel和新型-gel中的匹配LCOs，验证它们保留了母体肿瘤的遗传突变。LC组织与其相应LCOs表现出83.3%至97%的高一致性。新型-gel中的LCOs的变异等位基因频率（VAF）分布与原始LC组织非常相似。在Con-gel和新型-gel中培养的LCOs保留了TP53、BCLAF1等驱动突变，以及USP8、KEAP1等癌变基因的遗传变化。LC组织与相应LCOs之间的基本体细胞突变模式得以良好保留，主要碱基替换类型包括C > T/G（Ti）和C > A/G > T转换（Tv），与肺癌突变谱一致。进一步RNA测序分析显示，新型-gel和Con-gel中培养的LCOs的基因表达谱高度一致，整体基因表达相关性超过0.948。PCA结果显示新型-gel中培养的LCOs能有效地保留其在Con-gel中观察到的RNA表达特性(图4)。
图4 新型-gel水凝胶培养的LCOs保留了原始组织的遗传特征
新型-gel培养的LCOs保持药物敏感性。作者评估了在新型-gel中培养的六种LCOs对肺癌常用药物（阿霉素、顺铂、厄洛替尼和紫杉醇）的药物敏感性。培养7至10天后，LCOs经过3至5天的药物处理，然后评估其细胞存活率。结果显示，不论是在Con-gel还是新型-gel中培养的LCOs都展示出一致的药物反应模式，表明中尺度胶原束并未显著改变化疗药物的敏感性。然而，不同患者来源的LCOs在Con-gel和新型-gel中对四种化疗药物的反应差异显著。例如，LCO-1对所有药物均无敏感性，而LCO-2对阿霉素和厄洛替尼敏感，但对顺铂和紫杉醇表现出耐药性(图5)。这些结果强调了进行快速的体外药物敏感性测试以优化个体化化疗方案的重要性。
图5 conc -gel和新型-gel中培养类器官的药物测试
与传统的 M-gel比较：
新型-gel 通过使用直接来自患者的胶原束成分，提供了一种更加个性化的方法，与来自 Engelbreth-Holm-Swarm 小鼠肉瘤细胞的 Matrigel 相比 ，这表明 新型-gel 更适合个性化患者治疗。此外，MC-gel 的杨氏模量为 12.56 ± 2.7 kPa ，与肺肿瘤组织的杨氏模量 (12.73 kPa) 非常接近，而 Matrigel 的杨氏模量通常约为 1.29 kPa 。此外，新型-gel 旨在复制肿瘤细胞外基质复杂的胶原结构，这对调节细胞表型、机械转导、生长因子通讯、长距离细胞间相互作用和癌细胞浸润有显著影响。
文章信息：https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2024.04.035
方法：
1.中尺度胶原束制备
用冷 PBS 将肿瘤样本清洗两次，然后切成 1-2.5 mm3用剪刀将组织切成碎片。随后将切碎的组织与 5 ml 胶原酶Ⅰ（3 mg/ml）和 ROCK 抑制剂 Y-27632 二盐酸盐（10 μM）一起在 15 ml 离心管中孵育 1.5 h，使用恒温培养振荡器（WS20，上海）设定转速为 50 rpm，维持在 37 °C，直到观察到大量絮状沉淀和细胞悬浮液。消化后，将组织样本通过细胞过滤器（70 μM）以从单细胞悬浮液中分离出大的未消化的簇。随后将大的未消化的簇在 −80 °C 和室温下进行多次冻融循环以消除剩余的细胞。随后，使用组织研磨机（Fish Scientific）以 6.5 m/s 的速度在 4 °C 下将剩余的纤维均质化。均质化过程包括摇动 1 分钟，然后保持 1 分钟，总共重复 7 个循环。这导致生成中等大小的胶原束，长度约为 90 ± 27 μm，平均直径为 3.5 至 6.5 μm。随后将中等大小的胶原纤维浸泡在 75% 酒精中 1 小时，使其灭菌并失活，然后用无菌去离子水彻底清洗（4-5 次）以保存。将中等大小的胶原纤维浸泡在75%酒精中1小时进行灭菌和灭活，然后用无菌去离子水彻底清洗（4-5次）以供保存。将中等大小的胶原纤维浸泡在75%酒精中1小时进行灭菌和灭活，然后用无菌去离子水彻底清洗（4-5次）以供保存。
2.弹性模量测量
根据制造商的说明，使用位移控制的 PIUMA 纳米压痕仪（Optics11，荷兰阿姆斯特丹）进行纳米压痕测试。简而言之，使用 Pattex 胶将具有不同浓度中尺度胶原蛋白束的 mTGase 交联明胶固定在玻璃底盘上。球形尖端半径为 50 μm ( k = 0.5 N/m) 用于样品测试。在每组实验之前，通过在固体表面施加压力并建立悬臂弯曲和探针位移之间的等效性来校准悬臂弯曲。校准后，将装有样品的盘子放在 PIUMA 样品台上。样品在室温下浸入 PBS 中，确保纳米压痕仪尖端在整个过程中保持在溶液表面以下，以防止由空气-水界面的强粘附力引起的误差。每个样品的应力测试进行 5-6 次，确保测量之间的最小距离为 200 μm。每个样品的有效杨氏模量是通过多次测量计算出来的。每组至少进行四次独立测试以进行量化。
3. 流变测量
采用美国TA Instruments公司的HR20旋转流变仪对材料进行流变性能评价，该设备具有精密设计的直径20 mm测试平台，间隙尺寸为500 μm。在允许180 s的热平衡时间后，在整个实验过程中，系统温度恒定为25 ℃。应变扫描实验中施加的应变从0.1 %变化到100 %。在频率扫描实验中，在频率从0.1 %变化到100 %时，保持1 %的恒定应变值。最后，在应力松弛实验中，采用2 %的固定应变设置，总测试时间为600 s。
4.. 扫描电子显微镜（SEM）
制备新型凝胶和 Con 凝胶，并在液氮中速冻 10 分钟。随后，在 2 Pa 的压力下对它们进行 24 小时的冷冻干燥，以保持其多孔结构的完整性。使用手术刀小心地切割冷冻干燥的样品，并将其固定在铝制支架上。随后，通过溅射涂层将一层金涂在样品上，然后用 SEM（HITACHI，Regulus 8100）对其多孔形态进行成像，加速电压为 20 kV，初始放大倍数为 100 倍。对于孔径测量，每组量化了超过 100 个孔。
5. 傅里叶变换红外光谱（FTIR）
使用VERTEX70红外光谱仪（德国布鲁克）在反射ATR模式下对冻干水凝胶样品进行傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析，光谱范围为400~4000cm −1，从而获取有关化学官能团组成的微观信息。
6.膨胀系数
准确称量新型凝胶和 Con 凝胶，然后在室温下浸泡在过量蒸馏水中，孵育时间为 0、2、6、12 和 24 小时。然后，用镊子小心地取出膨胀的水凝胶，用滤纸轻轻擦拭以消除任何表面水分，然后重新称重。重复该过程，直到达到一致的重量。膨胀率是通过使用提供的公式计算三个值的平均值来确定的。膨胀率 = (Wb - Wa)/Wa × 100 %。其中，Wb 表示湿支架的重量，而 Wa 表示干支架的重量。
7.类器官培养
将按照“中尺度胶原束制备”部分所述方法获得的细胞悬浮液以 1000 g 离心 5 分钟，然后用 PBS 清洗，再以 1000 g离心 5 分钟。最后，将肿瘤细胞重新悬浮在浓度为 4% 的明胶溶液中。将 10 滴由 新型 凝胶（约 20 μL）和细胞（约 20,000 个细胞/滴）组成的混合物滴入六孔板的每个孔中。将它们小心地放入 37 °C 的环境中，在 5% 的 CO2 浓度下进行进一步孵育。凝固后，每个孔添加肺癌类器官培养基（2 毫升）。
8.H&E 染色和 IF 分析
将新鲜的肺肿瘤组织首先浸泡在10％福尔马林溶液中24至48小时，然后转移到70％乙醇溶液中进一步保存，再包埋在石蜡中。在新型-gel和Con-gel中培养的类器官浸泡在4％福尔马林溶液中24-48小时，然后用70％乙醇溶液中的伊红处理，再包埋在琼脂糖（2％）中，进行后续处理，包括H&E染色和免疫荧光（IF）分析。将包埋在石蜡中的肿瘤组织和类器官切成厚度约为4μm的切片，并在60°C的温度下干燥过夜。对于免疫荧光实验，使用柠檬酸溶液（pH 6）对石蜡载玻片进行抗原修复。) 脱蜡和复水后。使用一抗 Napsin A (ABclonal, A5594)、细胞角蛋白 5/6 (CK5/6) (Proteintech, 28506-1-AP)、TP63 (Proteintech, 12143-1-AP)、TTF-1 (ABclonal, A18128)、细胞角蛋白 7 (CK7, Proteintech, 17513-1-AP)、Ki67 (Proteintech, 27309-1-AP) 对制备的组织切片进行适当的抗体染色。然后用 PBS 冲洗载玻片，并在 25 °C 下与稀释的二抗一起孵育 1 小时。用 DAPI 标记细胞核。随后，使用 Leica 制造的共聚焦显微镜 (LSM900) 扫描和捕获载玻片。TTF-1 (ABclonal，A18128)、细胞角蛋白 7 (CK7，Proteintech，17513-1-AP)、Ki67 (Proteintech，27309-1-AP)。然后用 PBS 冲洗载玻片，并在 25°C 下与稀释的二抗孵育 1 小时。用 DAPI 标记细胞核。随后，使用 Leica 制造的共聚焦显微镜 (LSM900) 扫描和捕获载玻片。TTF-1 (ABclonal，A18128)、细胞角蛋白 7 (CK7，Proteintech，17513-1-AP)、Ki67 (Proteintech，27309-1-AP)。然后用 PBS 冲洗载玻片，并在 25°C 下与稀释的二抗孵育 1 小时。用 DAPI 标记细胞核。随后，使用 Leica 制造的共聚焦显微镜 (LSM900) 扫描和捕获载玻片。
9. DNA提取及全外显子组测序（WES）分析
使用 QIAamp DNA FFPE 组织试剂盒 (QIAGEN, 56404) 提取总 DNA，然后使用 Covaris M220 聚焦超声波破碎仪进行碎裂，随后进行测序文库构建准备。根据供应商提供的制造商协议，使用 Human Exome 2.0 Plus 试剂盒 (Twist Bioscience) 进行外显子组捕获。在 LC-Bio Technology Co., Ltd (中国杭州) 使用 Illumina NovaSeq 6000 测序系统 (Illumina) 对最终文库进行双端 150 bp 测序。比对之前，使用 fastp 软件消除包含测序接头或具有 q 质量20 的核苷酸的低质量读取。为了比对目的，我们使用了 BWA (Burrows Wheeler Aligner) 将读取与 hg19 参考基因组对齐。比对后处理包括使用 Broad Institute 存储库网站上的 Picard 工具识别和标记重复读取。此外，还进行了第二次比对后处理步骤，通过实施局部读取重新比对来解决插入/缺失附近的潜在比对错误。为了在变异调用之前减轻系统性偏差，对碱基质量分数进行了重新校准。通过结合使用 Mutect2 算法检测体细胞 SNV 和 InDel，而 ANNOVAR 将生物学信息纳入变异集。使用 CNVkit 软件工具集检测拷贝数变异 。根据序列的GC含量对读取分布进行标准化，有助于计算肿瘤和正常样本之间的拷贝数差异。
10. RNA测序
按照制造商的指导，使用 Trizol 试剂 (thermofisher, 15596018) 提取总 RNA。随后，我们使用 Bioanalyzer 2100 Nano LabChip Kit (Agilent, 5067-1511) 评估分离 RNA 的数量和纯度。为了构建测序文库，仅使用 RIN 数超过 70 的高质量 RNA 样本。为了从 5ug 总 RNA 中分离 mRNA，使用 Dynabeads Oligo (dT) (Thermo Fisher, 61005) 进行了两个纯化循环。随后使用二价阳离子 (NEB, e6150) 在 94 °C 下对纯化的 mRNA 进行 5-7 分钟的片段化。使用 SuperScript™ II 逆转录酶 (Invitrogen, 1896649) 通过 cDNA 合成将片段化的 RNA 转化为互补 DNA。接下来，DNA聚合酶I（NEB，m0209），RNase H（NEB，m0297），我们利用 R 进行相关性分析，通过新型-gel 和 Con-gel 中类器官平行实验的相关性来评估实验结果的可靠性和操作稳定性。为了评估样品之间的一致性，我们计算了 新型-gel 和 Con-gel 中四对类器官之间的 Pearson 相关系数。相关系数越高，表示在这些平行实验中观察到的可重复性程度越高。对于本研究，我们使用 R 中的 princomp 函数进行主成分分析 (PCA)。
11.体外药物研究
用于在实验室环境中进行药物测试的化合物，从 MedChemExpress 获得，并根据提供的指南溶解在二甲基亚砜 (DMSO) 或 PBS 中。将类器官解离成单个细胞、定量，然后接种在黑色 96 孔板中，每个孔有三个重复，每个孔包含 10,000 个细胞。这些培养皿孵育 7-10 天的生长期。随后将类器官暴露于 10 μmol/L 药物浓度中 3-5 天。之后，按照制造商提供的说明，使用 CellTiter-Lumi™ 发光检测试剂盒评估三维 (3D) 细胞 (Beyotime, C0061S) 的活力，从而评估细胞活力。为了在数据分析过程中标准化不同板之间的差异，我们计算了对照百分比。仅用 DMSO 处理的孔中获得的信号作为我们的阴性对照，设置为 0%，而每个单独的板上未经任何药物处理的孔则被指定为 100%。相对细胞存活率是根据三个生物学重复来确定的。
1. 3D 细胞/类器官培养水凝胶的替代
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自组装短肽技术最初源自于Zhang院士(世界著名科学家、奥地利科学院、美国麻省理工学院)，自组装短肽技术已经发表过＞10000+论文，其中关于细胞三维培养＞500篇，类器官培养的＞100篇。我们团队在国际国内较高水平学术刊物上发表论文如包括Biomaterials，CR，NPJ等以一作或者通讯作者发表的代表性的5篇SCI英文文章2021年统计总影响因子暂为>152.5，其中单篇现在的最高影响因子为～72.0。
Kemigel® 自组装短肽的特点
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6）不来源于动物，免疫原性小；
7）不会带传染病毒或疾病等，或者可能性极小；
8）降解成为氨基酸残基；
9）提供仿生的生长环境，基本可模拟体内的真实环境；
10）可以单独使用，也可组合使用
实验服务——密码子生物科技有限公司
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