过氧化氢酶(catalaseCAT)是一种广泛存在于生物组织中的氧化还原酶,它能催化过氧化氢(H2O2)分解为水和氧气,清除组织中的过氧化氢。H2O2 λ 240 nm处有一个吸收高峰,其吸光度与H2O2的含量成正比,过氧化氢酶能分解H2O2,使反应溶液吸光度A240随反应时间而降低。单位时间内吸收的差值就是过氧化氢酶的活性。

1 试剂

10.05 mol/L 磷酸缓冲液(PBSpH 7.8

20.15 mol/L 磷酸缓冲液(PBSpH 7.0

330%双氧水(H2O2

2 实验方法

2.1 样品前处理

称取0.2 g样品置于预冷的研钵中,分三次加入6 ml2 ml2 ml2 ml)预冷的磷酸缓冲液(pH 7.8),在冰浴上研磨成匀浆,转入10 ml离心管中,低温12000 r/min离心20min,上清夜即为酶粗提液。

2.2 测定方法

1)反应混合液的配制:取100 ml磷酸缓冲液(pH 7.0)于烧杯中,加入155 μl 30%的H2O2,混匀后保存于4℃备用。

2)酶活性测定:取2.9 ml反应混合液,加入40 μl酶液(可视情况调整)后测定λ 240 nm下的吸光度,10 s测定一次,测定120 s。以PBSpH 7.0)代替酶液作为对照调零。

2.3 计算公式

以每分钟内OD值变化(降低)0.01为一个酶活性单位(U)。按下式计算酶活性:


其中:

过氧化氢酶活性以酶单位每克鲜重每分钟表示(U/g·min);

ΔA240为反应时间内吸光度的变化;

Vt为提取酶液总体积(ml);

Vs为测定时酶液用量(ml);

W为样品鲜重(g);

t为反应时间(min)。