超氧物歧化酶(superoxidedismutaseSOD)普遍存在于动、植物体内,是一种清除超氧阴离子自由基(O2·-)的酶。本项目依据SOD抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下,核黄素可被光还原,被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2·-,可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙,后者在560nm处有最大吸收。而 SOD可清除O2·-,从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后,反应液蓝色愈深,说明酶活性愈低,反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。

1 试剂

10.05 mol/L 磷酸缓冲液(PBSpH 7.8

214.5 mM甲硫氨酸(Met)溶液

33 mM EDTA-Na2溶液

460 μM核黄素溶液

52.25 mM氮蓝四唑(NBT)溶液

2 实验方法

2.1 样品前处理

称取0.2 g样品置于预冷的研钵中,分三次加入6 ml2 ml2 ml2 ml)预冷的磷酸缓冲液(pH 7.8),在冰浴上研磨成匀浆,转入10 ml离心管中,低温12000 r/min离心20min,上清夜即为酶粗提液。

2.2 测定方法

取试管3支,1支为测定管,另外2支为对照管,按下表依次加入各溶液:



各管混匀后,将对照管1用锡箔纸包好置于暗处,其他各管于4000 Lx 光照下准确反应20 min。反应结束后,以对照管1作为空白调零,分别测定其他各管在560 nm下的吸光度。

注:可提前配置反应混合液(以60个样品为例):分别取Met溶液162 mlEDTA-Na2溶液6 mlNBT溶液6 ml,混合后充分摇匀。取2.9 ml混合液+0.02 ml酶液+0.1 ml核黄素。

2.3 计算公式

已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位(U),按下式计算活性。

其中:

SOD总活性以酶单位每克鲜重表示(U/g·FW);

SOD比活力以酶单位·每毫克蛋白表示;

Ack为照光对照管的吸光度;

AE为样品管的吸光度;

Vt为提取酶液总体积(ml);

Vs为测定时酶液用量(ml);

W为样品鲜重(g);

蛋白质含量单位为mg/g