考马斯亮蓝G-250法(Coomassie brilliant blueG-250)是一种利用蛋白质-染料结合的原理,定量测定微量蛋白质浓度的快速、灵敏的方法。考马斯亮蓝G-250存在着两种不同的颜色形式,红色和青色。该染料在游离状态下为红色,在酸性溶液中可与蛋白质的疏水区结合,颜色由红色转变成青色,其最大光吸收由 λ 465 nm变成 λ 595 nm。在一定蛋白质浓度范围内(1-1000μg),蛋白质-染料复合物在 λ 595 nm下的吸光度与蛋白质含量成正比。蛋白质和染料结合是一个很快的过程,约2 min即可反应完全,呈现最大光吸收,并可稳定1 h,之后蛋白质-染料复合物发生聚合并沉淀出来。

1 试剂

10.05 mol/L 磷酸缓冲液(PBSpH 7.8

2100 μg/ml标准蛋白质溶液

3)考马斯亮蓝试剂

2 实验方法

       2.1 标准曲线的绘制

        取6支试管,按下表加入各试剂,混合均匀后向各管中加入2.5 ml考马斯亮蓝试剂,摇匀并放置5 min左右,以0号试管为空白对照,在 λ 595 nm下测定吸光度。以蛋白质含量为横坐标,以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

2.2 样品前处理

称取0.2 g样品置于预冷的研钵中,分三次加入6 ml2 ml2 ml2 ml)预冷的磷酸缓冲液(pH 7.8),在冰浴上研磨成匀浆,转入10 ml离心管中,低温12000 r/min离心20min,上清夜即为蛋白粗提液。

2.3 测定方法

吸取0.5 ml蛋白粗提液(用蒸馏水适当稀释后)放入试管中,加入2.5 ml考马斯亮蓝试剂,摇匀并放置2 min左右,以0号试管为空白对照,在 λ 595 nm下测定吸光度,通过标准曲线方程查得蛋白质含量。

2.4 计算公式


其中:

可溶性蛋白含量以每毫克每克鲜重表示(mg/g·FW);

C为查标准曲线值(μg);

Vt为提取液总体积(ml);

Vs为测定时提取液用量(稀释前)(ml);

W为样品鲜重(g)。