短链脂肪酸具有挥发性,且基质复杂,增加了粪便中短链脂肪酸分析的难度。公司团队对样品除杂、衍生化等样品预处理方法及分析中涉及的色谱方法、色谱柱和检测器等进行总结,进一步优化用高效和灵敏的粪便短链脂肪酸分析方法。(咨询:13811619975 15837171623微信)


由于SCFAs具有极性大,挥发性强等特点,SCFAs检测难度大,且粪便等基质的复杂性更增加了样品前处理难度,因此,建立快捷高效的前处理方法及灵敏度高、选择性好的分析方法是短链脂肪酸定性、定量研究的关键。早期SCFAs定量测定主要采用滴定法,该法特异性不强,准确度差。随着色谱技术的发展,气相色谱法(gas chromatography,GC)、高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)以及毛细管电泳法(capillary electrophoresis,CE)等被广泛用于SCFAs的测定,取得了阶段性的进展。

1 样品预处理方法

由于SCFAs具有挥发性,且粪便中含有大量的食物残渣和肠道微生物,因此粪便预处理方法对SCFAs检测至关重要,是制约SCFAs定性、定量研究的瓶颈之一。

1.1 物理预处理方法

过滤、超滤、离心或者样本稀释]等是SCFAs检测中常用的样品前处理方法。该方法过程快速简便,但所得样品仍含有较多蛋白、磷脂等杂质,易导致色谱柱污染,降低分离度,继而影响定量的准确性。

1.2 有机溶剂萃取法

溶剂萃取法是利用化合物在2种互不相溶(或微溶)的溶剂中溶解度或分配系数的不同,使化合物在不同溶剂中转移的方法。比较了3种不同的有机溶剂萃取效果,发现采用乙酸乙酯是最有效的样品前处理方法,并成功检测到大鼠粪便中的8个SCFAs。采用二乙醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和甲基叔丁醚对样品中的SCFAs进行萃取,发现甲基叔丁醚有更好的萃取效果;三氯甲烷]、乙醚、乙醚乙腈混合溶剂均可用作SCFAs萃取溶剂。有机溶剂萃取剂的选择范围比较广泛,不发生化学反应,操作简单,但是后期存在萃取溶剂回收时SCFAs随之逸失等问题。

1.3 超临界萃取技术

超临界萃取技术(supercritical fluid extraction,SFE)是最近发展起来的一种高效、安全的萃取技术。预先采用Ba2+沉淀尿液中的磷酸根和硫酸根离子,然后在富集了SCFAs的阴离子交换树脂上用SFE技术对SCFAs进行衍生化和提取,成功建立了一种快速的样品前处理方法,但是设备普及程度不高,限制了该方法的应用。

1.4 常压/减压水蒸气蒸馏法

水蒸气蒸馏是分离纯化有机化合物的重要方法之一,尤其是分离对温度敏感的物质,减压水蒸气蒸馏法是水蒸气蒸馏法的进一步改良,均可用来提取SCFAs。粪便中SCFAs浓度较低时,水蒸气蒸馏的回收率的RSO比减压蒸馏高2~10倍[。但是,减压蒸馏在应用时仍需注意SCFAs逸失导致的回收率偏低等问题。

2 SCFAs衍生化方法

衍生化主要是把难于分析检测的物质转化为稳定且易于分析的物质。SFCAs检测中常需要进行柱前衍生化,主要是通过增加结构中的发色基团提高紫外检测器等的响应,或者是通过降低其挥发性避免分析过程中SCFAs的逸失,使测定结果更加精准。

2.1 衍生化以提高稳定性

羟基、羧基、胺、硫醇、磷酸盐等官能团在GC分析高温环境下可能不稳定,因此需要通过某些硅基化试剂进行衍生化。在预处理过程中,应注意防止挥发性衍生物的蒸发而引起的SCFAs损失。为了避免这种情况,在SCFAs衍生化过程中通常还会引入氯甲酸酯[。Zheng等以氯甲酸丙酯为衍生化试剂,进行样品的预处理,测定了人类粪便、血清中的14个SCFAs,以提高方法的稳定性。

2.2 衍生化以提高灵敏度

SCFAs的衍生化提高了HPLC检测分析的灵敏度。衍生化试剂主要有单硝基取代的硝基苯肼,以吡啶作为催化剂,水溶性的碳化二亚胺试剂作为偶联剂,与SCFAs进行衍生化,该方法适用于衍生化含有羧酸、醛、酮等基团的化合物。]应用以上方法对SCFAs进行衍生化,提高其检测灵敏度,成功建立了SCFAs的HPLC-DAD/MS分析方法,是一种可广泛应用于SCFAs检测的衍生化方法。

2.3 衍生化以提高分离度

将样品进行简单的酸化也是一种可用于SCFAs检测的前处理方法,酸化剂主要包括盐酸、磷酸、甲酸、硫酸及草酸等,酸化有利于提高SCFAs的分离度。]在气质联用中分别对样品进行酸化的预处理,可以较好地防止SCFAs分析过程中产生死吸附,减少峰拖尾、肩峰现象,有利于后期的定性、定量分析处理。SCFAs的HPLC分析,主要采用高氯酸或硫酸对其进行酸化,有利于脱蛋白,同样可起到除杂和提高分离度的作用。

3 分析方法3.1 GC法

GC法具有分离效率高,分析速度快,样品用量少和检测灵敏度高等优点。

1952年GC被首次用于SCFAs检测。

3.1.1 检测器的选择

GC气相色谱的检测器有火焰离子化检测器(flame ionization detector,FID)、热导检测器(thermal conductivity detector,TCD)、电子俘获检测器(electron capture detector,ECD)、火焰光度检测器(flame photometric detector,FPD)、氮磷检测器(nitrogen-phosphorus detector,NPD)、光离子化检测器(photoionization detector,PID)、红外光谱检测器(infrared spectrum detector,IRD)和质谱检测器(mass detector,MSD)等。FID是一种高灵敏度通用型检测器。相关文献表明,FID在短链脂肪酸定量分析方面具有优势,是一种首选的GC检测器。

GC-MS联用技术具有可同时对SCFAs进行定性及定量研究的优点,应用该技术对生物样品中的SCFAs进行分析,方法精密度及回收率等均满足定量检测要求,并可获得相关化合物的结构信息,同时完成定性定量研究。

3.1.2 色谱柱的选择

气相色谱柱现常用毛细管柱,主要包括非极性柱(如DB-1)、弱极性柱(如DB-5)、强极性柱(如FFAP),由于SCFAs极性大,FFAP柱对于SCFAs具有很好的分离效果。一种方法是以FFAP毛细管柱对人和大鼠结肠中的SCFAs进行了测定,测定了8个SCFAs的含量,重复性与回收率等均满足定量要求。一种方法是采用DB-FFAP毛细管柱对Beagle犬脑脊液-血浆-粪便中SCFAs进行了快速检测,方法简单、灵敏,从脑脊液、血浆中检测到7个SCFAs,粪便中鉴定了8个SCFAs。另外,与FFAP色谱柱具有相同特性的毛细管柱(Econo-Cap EC-1000)也被广泛用于SCFAs测定。可见,基于SCFAs极性强,在开发GC分析检测方法时,尽量选择强极性毛细管柱,有利于获得最佳的保留时间和分离度。

3.2 HPLC法

HPLC法检测SCFAs具有简便、快速等特点。由于SCFAs易挥发且分子结构中缺乏具有紫外和荧光吸收的基团,常采用柱前或柱后衍生化对SCFAs进行结构改造,用紫外或荧光检测器进行检测。

3.2.1 检测器的选择

HPLC常用检测器有紫外检测器(ultra violet detector,UVD)、示差折光检测器(refractive index detector,RID)、电导检测器(electrical conductivity detector,ELCD)、电化学检测器(electrochemical detector,ECD)、质谱检测器(mass detector,MSD)。

UVD是HPLC分析最常用的检测器,检测结果不受温度变化、流动相组成和流速的影响。文献等用HPLC-UV法对人类粪便中SCFAs的含量进行检测。谭力等用HPLC-UV法测定了生物样品(包括结肠组织、粪便、唾液、十二指肠液、尿和血浆)中的SCFAs含量,结果与GC所测得结果相似。Ferrario等采用紫外检测器-示差折光检测器(UV-RI)联用技术,成功对粪便中的SCFAs进行测定,进一步扩展了方法的检测范围。可见,多种检测器联用技术是一种有效补充紫外检测器不足的策略。

RID通用性强,但灵敏度较低,对温度、压力等变化敏感,色谱柱和检测器均需保持恒温环境。通过模拟人体肠道消化系统环境,应用HPLC-RI对添加不同浓度的膳食纤维发酵体系进行了SCFAs含量的测定,发现儿童粪便提取物发酵体系中SCFAs水平高于成人。该检测器用于SCFAs分析时无需对其进行衍生化,可直接检测分析,可有效简化样品前处理过程,缩减分析周期。

ELCD主要用于测量无机离子和小分子有机物(有机酸和胺)。它是一种高度灵敏的检测器,但对温度变化非常敏感。]应用该检测器对结肠癌患者术后肠道环境的SCFAs进行测定,发现术后肠道环境中SCFAs显著减少。作为一种对温度过于敏感的检测器,在实际运用中会存在稳定性、重复性差等问题,可作为一种备用检测器类型。

ECD以测量物质的电信号变化完成检测,灵敏度高,可直接对无发射基团的化合物进行分析,精简预处理过程并缩短分析时间。]应用ECD对大鼠和人类粪便中的SCFAs进行测定,SCFAs的重复性的RSD < 2.7%,回收率超过92%,证明该检测器具有临床和生物医学应用潜力。

MSD是另一种通用型检测器,灵敏度高、选择性强,同时能提供化合物的相对分子质量和结构信息。应用MSD对人类粪便中的SCFAs进行测定,成功地开发并验证了用衍生化试剂和UPLC/MRM-MS进行化学衍生物的分析方法,精确地测定了10个SCFAs。Meesters等[59]应用MSD对猪血清中的SCFAs进行测定,为研究其他器官中的SCFAs奠定了基础。

3.2.2 色谱柱的选择

在反相高效液相色谱法(reversed-phase high performance chromatography,RP-HPLC)检测中,以C18硅胶为填料的色谱柱最为常用。用YMC-Pack FA色谱柱在人类粪便中检测8个SCFAs。用YMC-Pack ODS-AQ色谱柱,分析了7个SCFAs。用YMC-Pack Pro C18色谱柱对小鼠粪便中SCFAs进行测定,该色谱柱与传统ODS柱相比,在传统ODS柱基础上采用更高纯度硅胶基质及更先进端基封尾技术,耐用性和重现性更佳,对化合物具有更好的分离效果。

离子色谱柱是以低交换容量的离子交换树脂为固定相对离子性物质进行分离,用ELCD连续检测流出物电导变化的一种色谱方法。有3种分离方式,它们是高效离子交换色谱(high performance ion exchange chromatography,HPIC)、离子排斥色谱(high performance ion exclusion chromatography,HPIEC)和离子对色谱(ion-pair chromatography,PIC)。]用Aminex HPX-87H离子交换色谱柱,对SCFAs的含量进行测定。Ferrario等用离子交换色谱柱对SCFAs进行测定,研究益生菌对微生物群及SCFAs水平的影响,发现粪便中丁酸水平是一种重要的生物标志物,可用于鉴别益生菌对受试者的治疗效果。Valerio等用离子排斥色谱柱对人类粪便中的SCFAs进行测定,确定5个SCFAs的定量限。宗艳平等采用离子交换色谱柱和离子排斥色谱柱联用法对琥珀酸进行测定,方法重复性好、准确度高、专属性和耐用性强。RP-HPLC与离子排斥色谱柱联用时检测范围大,分离度好,也是一种具有开发优势SCFAs液相色谱分析方法。

3.3 高效毛细管电泳法

高效毛细管电泳法(high performance capillary electrophoresis,HPCE)是一类以毛细管为分离通道,以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术。HPCE与GC和HPLC相比,具有快速、简便,所需样品量少和反应条件温和等优点,适用于SCFAs常规分析。

UVD、激光诱导荧光检测器(laser induce fluorescence detector,LIF)、ECD)和MSD均可用与CE联用对SCFAs进行检测,其中以UVD应用最广。间接和直接毛细管电泳-紫外检测法(CE-UV法)都曾被用来测定SCFAs,其中间接CE-UV法因可对SCFAs进行快速有效地分离而被广泛应用。

通常CE-UV用于SCFAs检测时分离度较好,但该方法灵敏度较低;毛细管电泳-激光诱导荧光法(CE-LIF法)提高了灵敏度,但分离范围窄,这是因荧光试剂的质量大和荧光衍生化试剂的反应活性等问题引起的。因此,寻找出最佳衍生化试剂是进行CE-LIF分析的一个难点。

4 展望

SCFAs作为肠道内碳水化合物的细菌发酵产物,既可以调节肠道微生物菌群多样性,使肠道微生态系统处于良好的状态,还可以预防肿瘤的发生,抑制肿瘤细胞的增殖等生物活性,所以实现对SCFAs的定性和定量是肠道菌与健康相关性研究的关键。

随着科技发展和研究的深入,粪便中SCFAs分析在样品前处理和分析方法方面仍有许多提升的空间。

4.1 样品前处理技术

当前还有几个有望用于粪便中SCFAs分析的样品前处理技术。

4.1.1 固相萃取技术

固相萃取是一种常用的生物样品预处理技术,主要用于生物样品中化合物的分离、纯化和浓缩。特别是固相微萃取技术,是一种更快速、更有选择性、更灵敏的技术。与传统的液液萃取法相比较可以提高分析物的回收率,更有效地将分析物与干扰组分分离,减少样品预处理过程,操作简单、省时、省力,是一种有望用于SCFAs的提取、富集方法。

4.1.2 液相微萃取技术

液相微萃取是近年来发展起来的一种新型的样品前处理技术,该技术集采样、萃取和浓缩于一体,需要有机溶剂量非常少,是一种环保的萃取技术。目前,该技术主要与GC或GC-MS、HPLC和CE联用,用于一些难挥发和半挥发的环境污染物以及生物样品中低浓度药物的分析,因此,有望开发相关前处理方法用于SCFAs的提取和富集。

4.1.3 吹扫捕集技术

吹扫捕集技术从理论上讲,是动态顶空技术,是用流动气体将样品中的挥发性成分”吹扫”出来,再用捕集器将吹扫出来的有机物吸附,随后经热解吸将样品送入GC仪进行分析的技术。该技术无需使用有机溶剂,对环境不造成二次污染,而且具有取样量少,富集效率高,受基体干扰小及容易实现在线检测等优点。吹扫捕集样品预处理技术与GC-MS联用已用于粪便样品分析,应用该方法有望实现粪便中SCFAs在线监测。

4.2 色谱分析方法

GC是目前应用最多的SCFAs检测方法,HPLC和CE虽然具有分析条件温和,准确度高等优点,但检测条件受检测器制约,存在各种局限。GC、HPLC及CE与MS检测器联用,可同时获得定性、定量数据,特别是在分析复杂生物样品时,MS的高灵敏度和选择性使其成为首选检测器。随着分析仪器的发展,在线分离和多仪器联用特别是多维色-质谱联用技术将进一步发展,有望为SCFAs研究提供技术保障。