生物体内的短链脂肪酸(Short-chain fatty acids, SCFA)是大肠细菌代谢的主要终产物,主要由厌氧微生物发酵难消化的碳水化合物而产生。当前用于检测粪便、血浆、血清、脑脊液、唾液、呼出气、瘤胃液、肠内容物、粪便培养液等生物样品中SCFA的方法较多,各有优劣。


生物样品中SCFA的分析
1 样品前处理方法
        生物样品的前处理是体内药物分析及内源性成分分析最为关键的一步。生物样品中的SCFA极性大、挥发性强和水溶性大的独特性质决定了其前处理方法与中链和长链脂肪酸有较大区别。目前已分析了SCFA的生物样品主要有粪便、血清/血浆、呼出气、唾液、瘤胃液、肠内容物等,这些样品的前处理方法有如下几种。
1.1 蒸馏法
        蒸馏法是指利用被测物质中各组分挥发性的不同来进行分离的方法,具有设备简单、容易操作、成本低、提取率高等优点。 此法已用于分析粪便、血清/血浆样品中的SCFA。然而采用蒸馏法处理粪便样品时对样品量需求较高;且对于血浆样品会使其中的乙酰基热解,从而增高乙酸值;此外,在强酸酸化过程中会造成蒸汽污染。因此,蒸馏法现已很少用于生物样品SCFA的分析。
1.2 高速离心法
        高速离心法是指利用离心机在高速旋转时产生的离心力使样品达到分离目的的操作过程,属于物理分离技术。此方法操作简便、有助于缩短工作流程,并能降低样品损耗。此法已用于分析粪便、血清/血浆样品中的SCFA。但高速离心法需要使用高速离心机;分离粪水样品时容易混有其他类型的有机酸。
1.3 超滤法
        超滤法是使用超滤膜对溶液中各种溶质分子进行选择牲过滤的方法,溶液在一定压力下或离心力作用下通过超滤膜时,溶剂和小分子通过,而大分子或固体颗粒受阻保留。超滤膜的分子截留量通常1~1000KD之间,选用不同分子截留量的超滤膜,可以将相对分子质量在几百到几十万道尔顿之间的物质进行分离。这是近年来发展起来的新方法,具有操作简便、实验条件温和、分离速度快、回收率高等优点。此法已用于分析粪便、血清/血浆样品中的SCFA。采用超滤膜处理样品时,有一部分有机酸会吸附在滤膜上,造成定量不准确,且含量低的样品不易被检测出;此外,超滤膜通常为一次性用品,实验成本较高。
1.4 去蛋白
        含有蛋白质的体液在测定时会产生泡沫、浑浊或沉淀而干扰测定,另外,用RP-HPLC法进行分析时,体液中的蛋白质(以及脂类、盐类和其他内源性杂质)会沉结在色谱柱上,大大缩短色谱柱的寿命。因此,生物样品分析时去蛋白是必要的。常用的去蛋白方法有加酸沉淀法、加有机溶剂沉淀法、盐析法、等电点沉淀法等。常用的酸沉淀剂有高氯酸、三氯乙酸和磺基水杨酸等,其中高氯酸去蛋白较完全,但降低了检测样品的pH而造成仪器损伤。使用有机溶剂去蛋白则可以较好的从变性蛋白上萃取出分析物,并且可以克服酸沉淀法的缺点,常用的有机溶剂沉淀剂有甲醇、乙腈、异丙醇等,它们沉淀蛋白的能力大小一般为:乙腈>丙酮>乙醇>甲醇。
1.5 萃取法

        萃取法包括液-液萃取(Liquid-liquid extraction, LLE)、液-固萃取法(Liquid-solidextraction, LSP)、固相微萃取 (Solid phase microextraction, SPME)、液相微萃取(Liquidphase microextraction, LPME)和液膜分离(Liquid membrane permeation, LMP)。萃取法适用于大多数生物样品的前处理,他们的优缺点及适用的生物样品如下。 

        LLE

提取操作简单、 成本低、不需要特殊的实验设备
难以实现自动化,回收率低
粪便、血清 /血浆
        LSP
净化效果好、回收率高、重现性 好、所需溶剂量小、对成分选择性高
载面积小,流量低;易堵塞;易产生缝隙而降低提取效率
粪便、血清 /血浆
        SPME
所需溶剂量小; 设备简单,易与 GC,GC/MS联用,且有着良好的灵敏度;所需样品量少,为 1~10mL
萃取头比较昂贵,易碎,寿命较短;新萃取头老化所用涂层可能有污染物
粪便、血清 /血浆
        LPME
克服了固相微萃取可能存在的交叉污染问题,
萃取回收率易受多种因素影响
血浆、尿液、 唾液
        LMP
萃取与反萃取同时进行、萃取剂用量少和溶剂流 失量少
萃取回收率易受多种因素影响
血清/血浆
1.6 衍生化
        衍生化是利用化学反应将待分析化合物转化成为一些化学结构类似的其他物质。其作用主要是把难于分析的物质 转化为易于分析的化学结构相似的物质,更方便的应用于分离和检测。一般化学衍生化的目的主要有:提高样品检测的灵敏度;改善样品混合物的分离度;适合于进一步做结构鉴定,如质谱、红外或核磁共振等。 在利用GC分析SCFA时,由于羧基的极性大,在GC柱中容易产生吸附从而使结果的重现性差,这种情况在低浓度 (<1mmol/L)会时常发生,因此SCFA常需要先衍生化处理才能进入GC柱。SCFA衍生化还可以降低某些挥发性酸的蒸发损失。用苯甲酰基甲基溴酯化SCFA,可以减少SCFA的损失, 增加衍生化效率。SCFA常被衍生成位苄基酯或五氟苄基酯。 在利用HPLC或CE分析SCFA时,由于脂肪酸分子结构中缺乏具有紫外吸收和荧光的基团,常对脂肪酸进行衍生化后用紫外或荧光检测器检测。紫外衍生试剂往往含有苄基、对硝基苄基、对-甲硫代苄基、苯甲酰甲基、对-溴苯甲酰甲基等基团。常用的荧光衍生试剂一般有香豆素类、重氮甲烷类、喹啉类、苯并酰肼类以及磺酸酯类化合物。
2 SCFA的检测方法
2.1 GC法
        由于SCFA极易挥发,因此GC在SCFA分析中使用最为广泛。在GC分析中,程序升温、分流比、色谱柱类型、载气和检测器等条件都是决定测定结果准确度和可靠性的重要因素,因此建立分析方法时,均需对这些分析条件进行系统优化。 氢火焰离子化检测器(FID)是测定SCFA最常用的检测器之一,它的灵敏度较高。但生物样品中的SCFA含量一般较低,因此用FID不易实现SCFA准确定量,且重现性低,尤其在甲酸的检测中不常用FID。由于GC与MS联用具有更高的灵敏度及选择性,且集定性、定量分析于一体,因此MS已成为当前分析生物样品中SCFA的最有效检测器。
2.2 HPLC法
        HPLC法在定性、定量测定SCFA的分析过程中条件温和,准确度好,且可选用的检测器多。目前主要是将SCFA进行柱前或柱后衍生化后,采用反相色谱柱或离子交换色谱柱分离,再采用紫外或荧光检测器检测。由于采用此法分析SCFA需要进行衍生化处理(操作繁琐、需优化衍生化条 件等)或需采用离子色谱(采用离子交换柱分离,分析成本高、普及率低;或在流动相中添加离子对试剂,操作繁琐、 减少仪器或色谱柱使用寿命),因此限制了其在SCFA分析中的应用。