1、技术原理
植物基因转化技术可分为两大类：一类是直接基因转移技术，包括基因枪法、原生质体法、脂质体法、花粉管通道法、电激转化法、PEG介导转化方法等，其中基因枪转化法是代表。
另一类是生物介导的转化方法，主要有农杆菌介导和病毒介导两种转化方法，其中农杆菌介导的转化方法广泛应用于双子叶植物的遗传转化。
基因转化-OE原理是将重组质粒转化到农杆菌感受态细胞中后，用含有重组质粒的农杆菌去侵染植物叶子切口，目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移和整合，然后通过组织培养技术，得到转基因植物。当构建的表达载体含有高活性组成型启动子时，目的基因就会被高活性启动子启动在细胞内过量表达，这就是基因转化过量表达。
基因转化-RNAi原理是在质粒或病毒载体中，利用RNA聚合酶启动因子U6或T7分别控制正义链和反义链的合成并退火形成双链siRNA，或在启动子下游设计带发夹结构的表达单位，自身退火形成双链siRNA。将重组质粒转化到农杆菌感受态细胞中后，用含有重组质粒的农杆菌去侵染植物叶子切口，细胞中与目标基因序列同源的双链小RNA可以高效、特异性地阻断目标基因表达，促使mRNA降解，诱使细胞表现出目标基因缺失的表型。在植物体中，RNAi被称为基因共抑制，也是一种体内抵御外在感染的重要保护机制。
2、技术优势
1)模仿或利用天然的转化载体系统，成功率高，效果好；
2)农杆菌介导的转化系统的机理研究得最清楚，方法最成熟，应用也最广泛；
3)农杆菌介导的转化系统转化的外源基因以单拷贝为多数，遗传稳定性好，并且多数符合孟德尔遗传规律，因此转基因植株能较好地为育种提供了中间选育材料；
4)农杆菌介导的转化系统操作比较容易，需要的仪器设备简单，成本低，易于推广。
3、应用领域
1)生产重组疫苗、抑生长素、胰岛素、干扰素、人生长激素等；
2)培育了一批具有抗虫、抗病、抗旱耐盐、耐除草剂等性状的转基因作物；
3)改善作物农艺性状如光合效率、肥料利用效率和改善品质等。
4、技术路线及时间周期
5、实施方案
1、目的基因克隆
1)引物设计：
基因转化-OE：我们建议客户提供目的基因的编码序列（Coding sequence, CDS），根据CDS序列设计可扩增完整CDS序列（无终止子）的特异性引物。因为不是所有读码框（ORF）都能被表达出蛋白产物，或者能产生生物学功能的蛋白。
基因转化-RNAi：我们建议客户一般采用200-300 bp片段插入沉默载体中，实验采用pHellsgate8 载体。pHellsgate8 RNAi载体构建方法采用BP重组反应。根据目的基因序列与其他物种基因序列进行比对，设计RNAi载体引物A-RNAi-attB-F（含attB位点）和A-RNAi-attB-R（含attB位点）。
2)若客户提供已测序验证的含有目的基因的T载体，则直接进行第5)步；若客户只提供植物材料，则进行第3)步。
3)使用本公司专门针对物种特性开发的RNA提取试剂盒进行提取样品总RNA提取。
4)反转录获得第一链cDNA。
5)以cDNA或含有目的基因的T载体为模板，使用特异性引物进行PCR扩增。
6)PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，并切胶回收。
7)使用DNA拓扑异构酶(DNA Topoisomerase)进行TA连接，转化感受态细胞后对阳性克隆进行菌落PCR鉴定，鉴定为阳性的再测序验证。
8)经过验证的TA质粒置于-80℃保存。
2、构建过表达载体
本公司使用ClonExpress®技术，无须中间载体，一步将目的片段定向克隆进入植物过表达载体中。详细操作请见“载体构建”。可根据客户需求使用不同抗性（卡那霉素、潮霉素、庆大霉素、除草剂）的植物表达载体。
3、冻融法转化农杆菌
用冻融法将过表达载体和RNAi载体转化到农杆菌菌株（GV3101、LBA4404、EHA105可选）中，具体操作如下：
1)吸取5-10 µl质粒DNA加入100 µl融化后感受态细胞，上下吹吸均匀，冰上放置30 min。
2)将混合液放入液氮中1 min。
3)将混合液取出，转入37℃水浴5 min融化后，加入650 µl新鲜LB液体培养基，28℃，150 rpm/min低速振荡3 h左右。
4)8,000 rpm离心30 sec，去上清，加100 µl液体培养基，悬浮菌体后涂于含抗生素和利福平的LB固体培养基中。
5)获得的转化菌株用于农杆菌侵染。
4、组培无菌苗，制备外植体
1)用75%的乙醇和20%次氯酸钠溶液分别依次漂洗种子10 min，再用无菌水漂洗3次，每次3 min，然后放在1/2MS培养基上进行培养，当烟苗长到四片叶左右时，取嫩叶进行分化。
2)将新鲜的无菌烟草叶片剪成1 cm见方的小块，接种于不含任何抗生素的烟草分化培养基上预培养2 d。烟草分化培养基为MS+2.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA, 蔗糖 30 g/L, 琼脂6 g/L， ph=5.8;
5、农杆菌侵染，诱导出芽
1)在取烟草外植体的同时将含有过表达质粒的农杆菌接种于含适当浓度的抗生素和利福平的YEB培养基中，28℃，250 rpm/min，振荡培养过夜；
2)将饱和的农杆菌菌液按1:100的比例注入到不含任何抗生素的YEB培养基中，28°C，250 rpm/min，振荡培养至OD600=0.5左右；
3)将预培养两天的烟草外植体浸到活化好的农杆菌菌液中10 min；
4)用滤纸将外植体上的残余菌液吸干，之后接种于不含任何抗生素的分化培养基上，暗培养两天；
5)将暗培养过的外植体转入筛选培养基上，每10 d继代一次。
6)再生苗长到1-2CM时切下，转入伸长培养基中瓶中培养。
6、抗性T0代植株再生
将分化出的不定芽移入生根培养基中生根，生根培养基为MS+0.2 mg/L NAA+ PPT 4 mg/L + Timentin 160 mg。
7、PCR检测阳性植株
待试管苗长到3-4片时，揭开封口膜，取少量叶子提取DNA，根据载体特有序列设计引物进行PCR扩增检测。
8、炼苗移栽（可选）
PCR检测为阳性的植株，在光照培养室中炼苗3-4 d，然后移栽到培养钵中。
9、收获T1代种子（可选）
加快生长周期，单株套袋，收获种子。
6、服务内容 周期 验收标准
目的基因克隆 3个工作日 PCR电泳图、测序报告
植物表达载体构建 10个工作日 PCR/酶切电泳图、测序报告
烟草遗传转化 约2个月 植株DNA PCR扩增目的基因电泳图特异条带
炼苗移栽（可选） 15个工作日 -
收获T1代种子（可选） 加速生长周期 -
目的基因转录qRT-PCR检测(可选） 10个工作日 目的基因转录数据
目的基因Southern blot（可选） 20个工作日 杂交电泳图
目的基因蛋白Western blot（可选） 20个工作日 杂交电泳图
